单细胞测序技术研究思路之蛋白质互作网络分析
随着高通量单细胞测序技术的发展，研究者可以获得上千个细胞的转录组数据。面对这些大量的数据，研究者如何深入挖掘，才能找到想要的“宝藏”呢？
图源网络
使用蛋白质互作网络分析方法，从编码蛋白质的角度去认识细胞间转录组变化，不仅能帮助挖掘不同细胞亚群的核心调控基因及其变化，还能了解单个细胞蛋白质水平上发生的变化，为后续深入研究蛋白质组提供参考。
本期通过两篇使用单细胞RNA测序研究小鼠乳腺发育、人类骨髓中非整倍体造血细胞的文献，对蛋白质互作网络分析方法进行介绍。
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虽然使用传统测序技术，在细胞群水平上描述了不同类型乳腺上皮细胞的基因表达特征，但单细胞水平的研究有助于全面认识不同类型乳腺上皮细胞间的异质性。
为此，Pal等（2017，Nature Communication）使用FACS（流式荧光细胞分选）对不同发育时期雌性小鼠乳腺细胞进行分选后，对乳腺细胞进行单细胞RNA测序。通过对460个不同发育时期雌性小鼠乳腺上皮细胞的转录组进行分析，研究者揭示了青春期前小鼠的乳腺上皮细胞转录组显著不同于青春期和成年小鼠。
为了确定个体发育期间可能调控上皮细胞转变的生物学相互作用，研究者根据人类直系同源基因的蛋白质-蛋白质相互作用数据，解读不同发育时期小鼠乳腺上皮细胞差异表达基因间的相互联系。此外，还根据基因功能对网络图中与信号转导和转录调控有关的蛋白质进行注释。
蛋白质互作网络分析结果显示，青春期前和青春期小鼠的乳腺上皮细胞间转录因子（TFs）和信号转导蛋白（STs）的表达存在差异（图1），这揭示了推动个体发育的潜在机制，与前人研究一致【2】。
为了便于比较，研究者从图1中抽取出部分网络进行展示。与青春期相比，青春期前上调的蛋白质多是对胞外基质组分合成十分重要和/或与基质存在相互作用（图2），如VIM、VCAM1、ITGB4/A4、CAMK2d、MAP3K3等基质蛋白，MATN2、SPARC、COL1A1等胞外组分，ZEB2、FOS、EGR1等TFs。表明微环境在产后早期腺体的导管发育中起到了关键作用。
下调的多种蛋白质多与NPM1和SUMO1相连（图3）。其中SUMO1催化翻译后的蛋白质修饰，在网络图中与腔特异性雄激素受体及腔结构蛋白（KRT8、KRT18和KRT19）存在直接联系，并与青春期才开始表达的E-CAD存在间接联系。
小结：研究者比较了不同发育时期小鼠乳腺上皮细胞中差异表达基因的蛋白质相互作用网络，这有助于研究者认识个体发育期间调控小鼠乳腺上皮细胞转变的潜在生物学机制。
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非整倍体造血细胞
癌细胞常出现染色体异常【3-7】。作为“良性疾病”如再生障碍性贫血（AA）和骨髓衰竭综合征（BMF）的演化末期事件【8,9】，恶性血液病如骨髓增生异常综合征（MDSs）和急性粒细胞性白血病（AML）中常观察到许多类型的染色体异常【10,11】。
在骨髓衰竭中，monosomy 7（缺失一条7号染色体的细胞）与骨髓增生异常综合征以及进展为急性白血病有关【4,8~13】。因而，确定7号染色体缺失的遗传机制可以帮助认识早期白血病形成的病理生理机制。然而，缺少区分细胞遗传学上正常和异常细胞的特定细胞膜标记，阻碍了对monosomy 7形成背后分子机制的深入研究【14~17】。
Zhao等（2017，Blood）通过荧光激活细胞分选技术富集5名骨髓衰竭且细胞遗传异常患者和4名健康者骨髓中的原始造血干祖细胞，获得了588个来源于患者和391个来源于健康者细胞的转录组数据。
研究者对其中3名患者monosomy 7细胞的表达下调基因进行了蛋白质互作网络分析，结果显示monosomy 7细胞中下调的基因多数是与免疫应答、DNA损伤检查点和细胞凋亡相关的；参与维持DNA稳定性的基因下调显著（图4）。
小结：由于参与维持DNA稳定性的基因在monosomy 7细胞中显著下调，研究者据此认为monosomy 7细胞可能存在基因组不稳定；monosomy 7细胞中参与免疫响应、DNA损伤检查点和细胞凋亡通路的基因表达下调，这可能促进具有更多基因突变monosomy 7细胞的克隆扩增。
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总结
对单细胞RNA测序数据进行蛋白质互作网络分析，允许研究者在单个细胞水平上将转录组变化与其表达蛋白质相互作用关系联系起来，这有助于研究者认识不同发育阶段或疾病发展阶段，不同聚群细胞的变化及其背后分子机制。
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对数据进行t-SNE降维聚类、伪时间分析、通路富集分析等等后，为了明确基因之间的关系以及转录水平变化可能引起的功能变化，可以应用STRING蛋白质互作数据对每个细胞亚群的差异表达基因进行蛋白质互作网络分析。
比如根据每个细胞亚群差异表达基因列表，从数据库中提取相应数据来构建互作关系网络。如图4中每个节点表示一个蛋白质，节点之间的连线表示两个蛋白质间存在相互作用，不同颜色对应不同的相互作用类型。从图4中可以看到，两个蛋白之间的连线不止一条，这表示两个蛋白间存在多种相互作用关系，连线越密集代表蛋白质间的联系越紧密。
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参考文献
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